非洲猪瘟单克隆抗体研究进展-专栏-海洋之神
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非洲猪瘟单克隆抗体研究进展
单克隆抗体在非洲猪瘟病毒快速诊断技术研究、致病机制、免疫机制和疫苗研制等方面有着重要的作用,加强对非洲猪瘟单克隆抗体研究意义重大,亟待进行。
非洲猪瘟单克隆抗体研究进展

非洲猪瘟单克隆抗体研究进展

黄一凡、高琦、贾伟新、张桂红、亓文宝

华南农业大学兽医学院

国家非洲猪瘟区域实验室(广州)

人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室

农业部人畜共患病重点实验室

农业部兽用疫苗创制重点实验室

广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室

摘要:非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起猪的一种急性、出血性、高度接触性、高死亡率的传染病。从20世纪中期以来,已在非洲、欧洲和美洲等数十个国家流行,并在近几年内蔓延至欧亚两洲接壤处的格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆、俄罗斯及中国,给各国海洋之神业带来了极大的危害,目前尚无有效的疫苗和药物用来预防或治疗该病。非洲猪瘟单克隆抗体具有特异性强、高效、灵敏、便捷、成本低等特点,单克隆抗体在非洲猪瘟病毒快速诊断技术研究、致病机制、免疫机制和疫苗研制等方面有着重要的作用,加强对非洲猪瘟单克隆抗体研究意义重大,亟待进行。

关键词:非洲猪瘟病毒;单克隆抗体;结构蛋白,P72蛋白

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,  ASFV)引起的一种急性、热性、出血性猪传染病,急性感染死亡率为100%。急性和亚急性ASF常在多种器官上表现出严重的血管性病变,如肾脏出血、淋巴结弥漫性出血、肺水肿、脾脏充血性肿大、弥散性血管内凝血和血小板减少等。其主要临床症状是高热、皮肤发绀、有出血点、呕吐和便血等。因此,ASF被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的法定动物疫病之一,我国将其列为一类动物疫病。1921年,在非洲的肯尼亚地区首次发现ASF。1957年,欧洲的葡萄牙第一次暴发ASF疫情,经过一段时间沉默后,该病于1960年在欧洲的一些国家出现并逐渐传播,2007年底进入俄罗斯。近年来东欧一些国家不断发生疫情,国际疫情形势十分严峻。2018年8月3日,农业农村部公布了辽宁省出现我国首例ASF疫情。截至2019年5月13日,全国31个省(市、自治区)和香港特别行政区先后出现130起疫情,给我国海洋之神行业及相关产业造成了巨大的经济损失。

1.非洲猪瘟病毒的分类及结构特征

ASFV是一种有囊膜的单分子线状双链DNA病毒,属于双链DNA病毒目、非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员,也是目前已知的唯一的虫媒DNA病毒。家猪、野猪和软蝉均为ASFV的宿主,猪单核细胞-巨噬细胞为ASFV主要的靶细胞。

病毒基因组全长约为170-190 kb,基因组中间是一段长度约为125 kb的保守区。ASFV的基因组有150-167个开放阅读框(ORFs),编码150-200种蛋白质,其中约50种为结构蛋白,主要结构蛋白有p72、p54、p30、 p49、p220、p62和CD2v蛋白等。

2.非洲猪瘟病毒主要的结构蛋白

p72蛋白是ASFV的主要结构蛋白之一,由B646L基因编码。p72是病毒粒子二十面体衣壳的重要组成部分,产生于病毒感染的晚期,约占整个病毒粒子蛋白的32%。p72蛋白在非洲猪瘟病毒结合和进入受体细胞过程中有很重要的作用,并对病毒粒子衣壳的产生起着至关重要的作用[17]。非洲猪瘟病毒大多数毒株的毒力都很强,但是免疫原性很低,只有少数几个蛋白具有免疫原性,有研究表明,不同区域ASFV毒株诱导产生的p72抗体的相应抗原表位都相当保守。p72蛋白的反应原性和抗原性很稳定,病毒感染后能够产生高滴度的抗p72抗体,常被用来作为血清学检测和免疫制剂。p72参与了病毒的吸附过程,针对p72的抗体可以阻断病毒与巨噬细胞的结合。因此非洲猪瘟单克隆抗体的制备主要是针对p72蛋白。

p54蛋白同样是非洲猪瘟病毒的重要结构蛋白,由E183L基因编码,蛋白分子中含有一段跨膜区域,主要集中于衍生的内质网膜处。p54蛋白的跨膜结构区域对病毒蛋白经过内质网膜转化成病毒包膜前体的过程十分重要,是非常重要的抗原蛋白。p54蛋白与细胞质动力蛋白DLC8可发生特殊的交叉反应,介导病毒的细胞内运输,在细胞对病毒内摄过程和病毒在细胞内的加工过程中都起着重要作用。p54蛋白在非洲猪瘟病毒的感染早期能诱导caspase-9和caspase-3激活,激活细胞凋亡作用,进而诱发细胞吞噬,这是非洲猪瘟发病机制中的重要环节。

p30蛋白是非洲猪瘟的一种膜蛋白,由CP204L基因编码,在病毒感染早期表达,能够引起机体产生免疫反应,因此该蛋白也具有比较好的抗原性,是一种重要的抗原蛋白。研究表明,针对p30蛋白的抗体能够抑制病毒内化,说明p30蛋白也参与病毒进入细胞的过程[25]。

3.非洲猪瘟病毒的单克隆抗体研究

由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备,杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上,将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群,可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆体。

图1.单克隆抗体制备过程

非洲猪瘟单克隆抗体对非洲猪瘟病毒的快速诊断、致病机制、免疫机制和疫苗的研制有着重大的作用。非洲猪瘟单克隆抗体(ASFV McAb)一是用于免疫学相关ASFV检测方法的建立,例如用于建立检测ASFV抗原的直接免疫荧光试验(DIF)、免疫酶组化试验、夹心法酶联免疫吸附试验等;二是用于病毒和抗原结构的研究及ASFV抗原特性的研究及疫苗的研制[26]。

4.国内外非洲猪瘟单克隆抗体研究进展

单克隆抗体具有特异性强,敏感性高的特点,从而广泛应用于对病毒及其特异性抗血清的免疫学鉴定。

早在1984年,Sanz等人就首次制备了针对ASFV的单克隆抗体,获得了241株稳定的杂交瘤细胞,对其中90株(针对6个蛋白)进行了特异性试验,对其中60株进行了分型。Garcia-Barreno等人于1986年发表于《Journal of Virology》上的论文,利用所制备的单抗(针对10个蛋白)识别ASFV抗原性的改变,鉴定了来源于非洲、欧洲和美洲不同ASFV毒株的抗原特性,并根据ASFV抗原性的不同对ASFV进行了分型[20]。Whyard等人于1985年制备了38株ASFV的单抗(针对5个蛋白),利用其中针对p72蛋白的单抗,建立免疫沉淀和免疫电镜技术,并对P72蛋白进行了深入研究。Zsak、Cobbold等人于20世纪90年代先后制备了针对P72蛋白的单抗;2018年 Mallory E. Heimerman等人利用杆状病毒表达系统制备了6株针对非洲猪瘟p72蛋白线性表位识别的单抗:mAb 85 (aa 165–171);mAbs 65-3 and 6H9-1 (aa 265–280);mAbs 8F7-3 and 23 (aa 280–294);and mAb 4A4 (aa 290–303)。

国内学者朱红等于2007年利用大肠杆菌表达的不溶性融合蛋白GST-P72,免疫小鼠制备了5株分泌P72的单抗杂交瘤细胞,用其制备的单抗经鉴定具有较好的特异性、稳定性、敏感性及较强的生物学活性,并以此建立了相应的ELISA检测方法;曹琛福等采用原核表达的重组蛋白p54制备所得单抗,对其抗原表位进行鉴定,发现第23-29位、第36-45位、第72-94位、第114-120位和第137-150位氨基酸为p54蛋白抗原位点,有较强的特异性和高亲和性,这也一定程度上证明了通过基因工程技术获得重组蛋白替代病毒作为抗原来源是可行的。

5.展望

近年来,国内外运用基因工程技术获得重组蛋白的方法变得越来越成熟、稳定和有效,且利用原核表达系统(如大肠杆菌表达系统)和真核表达系统(如杆状病毒表达系统)表达来获得抗原也十分安全和快捷。通过众多学者的研究,发现p72蛋白是ASFV主要的结构蛋白,因此制备的单克隆抗体也主要针对p72蛋白。

单克隆抗体的试验周期较长,环节也多,所以失败的概率也很高。目前国内主要是针对p72蛋白来进行单克隆抗体的制备,也有针对较强抗原性的蛋白如p54和p30蛋白的单克隆抗体制备,但相对较少。如能在对P72蛋白深入研究的同时,对其他抗原性较强蛋白有更细致的研究,进一步制备出相应的单克隆抗体,将对ASFV实验室诊断技术、致病机制、免疫机制和未来疫苗的研制产生积极的推动作用。

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